중합 효소 연쇄 반응 (PCR)이란 무엇입니까? 테스트에 대한 사실, 단계 및 사용

PCR (중합 효소 연쇄 반응)이란 무엇입니까?

폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)은 DNA 가닥이 침착 될 수있는 거의 모든 액체 또는 표면에 또는 그 위에 위치한 미량의 DNA (및 일부 경우에는 RNA)를 증폭시키는 데 사용되는 기술이다. PCR을 이해하는 열쇠는 모든 인간, 동물, 식물, 기생충, 박테리아 또는 바이러스가 자신의 종에 고유 한 DNA (또는 RNA) 서열 (뉴클레오티드 서열 또는 DNA 또는 RNA 조각)과 같은 유전 물질을 포함하고 있다는 것을 아는 것입니다. 그리고 그 종의 개별 구성원에게. 결과적으로, 샘플에 DNA 또는 RNA의 세그먼트가 포함 된 경우 PCR은 이러한 고유 한 서열을 증폭 (더 많은 동일한 사본으로 만들기)하는 데 사용되는 방법이므로 매우 높은 확률로 소스의 신원을 확인할 수 있습니다 (a 거의 모든 물질 시료에서 발견되는 미량 DNA 또는 RNA의 특정 사람, 동물 또는 병원성 유기체).

그러나 PCR 증폭은 확인 테스트의 일부일뿐입니다. 증폭이 완료되면 (아래 참조), 증폭 된 세그먼트는 알려진 출처 (예 : 특정인, 동물 또는 병원성 유기체)의 다른 뉴클레오티드 세그먼트와 비교해야합니다. 독특한 분절의 이러한 비교는 종종 분리 겔에서 인간, 병원체 또는 다른 공급원으로부터의 공지 된 뉴클레오티드 서열 옆에 PCR- 생성 뉴클레오티드 서열을 배치함으로써 수행된다. 전류는 겔을 통해 흐르고 다양한 뉴클레오티드 서열은 전하 및 분자 크기에 따라 "사다리"와 유사한 밴드를 형성한다. 이를 겔 전기 영동이라고합니다. 겔에서 동일한 수준으로 이동하는 밴드 또는 "사다리"단계는 뉴클레오티드 서열의 동일성을 나타낸다. 이 방법은 PCR 테스트가 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다 (그림 1 참조).

그림 1, Mycobacterium의 PCR 생성 DNA 단계와 같은 밴드 또는 "사다리"(CDC 제공)

그림. Mycobacterium cosmeticum의 반복 요소 (Rep) –PCR (A) 및 펄스 장 겔 전기 영동 (PFGE) (B) 패턴은 오하이오 주 2 명과 베네수엘라 1 명에서 분리됩니다. BOXA1R 프라이머 (3)를 사용하여 Rep-PCR을 수행하고, 제한 효소 AseI를 사용하여 PFGE를 수행 하였다. 레인 1, 2, 오하이오는 OH1 및 OH2를 분리하고; 레인 3, 4, 대조군 균주 ATCC BAA-878T 및 ATCC BAA-879; 레인 5, 베네수엘라 분리 VZ1. DNA 크기 표준은 100-bp (S1) 및 48.5-kb 마커 (S2)입니다.

PCR (중합 효소 연쇄 반응)은 어떻게 이루어 집니까?

1983 년 Kary Mullis는 DNA 서열을 증폭시키는 기본 단계를 알아 냈습니다. 그와 Michael Smith는 1993 년이 절차를 개발 한 공로로 노벨상을 수상했습니다. 몇 가지 기본 단계가 순서대로 있습니다. PCR은 적절한 화학 물질과 특별히 설계된 히터가있는 단일 튜브에서 수행 할 수 있습니다. 필요한 시약 또는 화학 물질은 다음과 같습니다.

• 뉴클레오티드 서열을 포함하는 샘플 (혈액, 모발, 고름, 피부 긁기 등)
• DNA 프라이머 : 상보 적 뉴클레오티드 가닥의 합성을 촉진하는 뉴클레오티드 서열에 부착되는 짧은 단일 가닥 DNA
• DNA 폴리머 라제 : DNA에 프라이머 결합이있을 때 DNA 빌딩 블록을 부착하는 DNA 세그먼트를 내려가 상보성 염기쌍을 형성하여 DNA의 상보 적 뉴클레오티드 가닥 (내열성 DNA 폴리머 라제 도입, Taq)을 합성하는 효소 내열성 박테리아에서 유래 한 중합 효소 (Polymerase)는 PCR 수행 능력을 현저히 향상 시켰습니다.)
• 뉴클레오티드 (Adenine, Thymidine, Cytosine, Guanine, 각각 A, T, C, G로 약칭 됨)라고하는 과량의 DNA 빌딩 블록이 용액에 존재합니다. 이들 블록이 서로 연결되면, 뉴클레오티드 서열 또는 단일 가닥의 DNA를 형성한다. 이들 빌딩 블록이 약한 수소 결합에 의해 그들의 상보적인 빌딩 블록에 결합 할 때 (예를 들어, A는 T와 G 와만 결합하고 C 와만 결합 할 것이다) 상보 적 DNA 뉴클레오티드 서열이 형성되고 원래의 단일 가닥 DNA에 결합된다. 결합이 완료되면, 상보적인 이중 가닥 DNA가 특정 서열로 형성된다.

이어서, PCR은 상기 열거 된 시약을 갖는 튜브에 배치 된 샘플로부터의 DNA 세그먼트로 시작한다. 용액을 94 ℃ (201.2F) 이상으로 가열하고; 이 열은 상보적인 DNA 가닥이 형성되도록하는 수소 결합을 파괴하므로 혼합물에는 단일 가닥 만 존재합니다 (이중 가닥 DNA의 변성이라고합니다).

혼합물을 약 54 ℃ (129.2F)로 냉각시켰다. 이 온도에서 DNA 프라이머와 DNA 폴리머 라제는 개별 단일 가닥 DNA에 결합합니다 (DNA 소둔이라고 함). 빌딩 블록이 혼합물에서 초과 (고농도)하기 때문에, 폴리머 라제는 이들을 사용하여 새로운 상보 적 DNA 가닥 (DNA의 연장으로 지칭 됨)을 만들고, 이 과정은 72 ℃ (161.6F)에서 더 빠르다. 이 과정은 원래 분자의 각 단일 가닥으로부터 새로운 이중 가닥 DNA 분자를 만듭니다.

이 사이클은 가열-냉각 사이클이 완료 될 때마다 각각의 DNA 서열의 양이 두배가되는 가열-냉각 사이클을 자동으로 반복하는 열 사이 클러라고 불리는 기계에서 약 40 회 반복된다. 처음에 DNA의 단일 단편이었던 것은 40 배의 두 배주기 후에 약 1, 000 억 카피로 증폭 될 수 있습니다.

의사가 PCR (중합 효소 연쇄 반응) 검사를 주문한 이유는 무엇입니까?

PCR 검사는 의사가 환자를 진단하고 치료하는 데 도움이되는 여러 가지 의학적 질문에 답변 할 수있는 여러 검사의 기초를 형성합니다. 예를 들어, PCR 검사는 환자의 병원성 유기체, 특히 배양하기 어려운 유기체 (예 : HIV 및 기타 바이러스 및 특정 곰팡이)를 감지하고 식별 할 수 있습니다.

다른 의사는 유전자 질환을 진단하기 위해 PCR 검사를 지시하는 반면, 다른 의사는 PCR을 사용하여 자녀의 부모를 식별하는 것과 같은 생물학적 관계를 탐지합니다. PCR 검사는 특정 암에서 발견되는 유전자 돌연변이와 재 배열을 식별하고 특성화하는 데에도 사용됩니다.

그러나 PCR 시험은 진화 생물학, 유전자 지문, 법의학 조사 및 기타 여러 가지를 포함한 과학적 조사의 여러 측면으로 수정되고 확장되었습니다.

RT-PCR이란 무엇입니까?

RT-PCR은 RNA를 감지하고 측정하도록 설계된 PCR 테스트입니다. 초기 PCR 테스트에서 DNA가 증폭되었지만 많은 바이러스 및 기타 생물학적 구성 요소 (예 : 미토콘드리아)는 유전자 물질로 RNA를 사용합니다. RT-PCR은 먼저 RNA를 취해 RNA 가닥을 DNA 가닥으로 변환함으로써 기존의 PCR과 다릅니다. 이는 DNA 폴리머 라제 대신 역전사 효소 라 불리는 효소를 사용하는 것을 제외하고는 전술 한 PCR에 대해 본질적으로 동일한 방법으로 수행된다. 역전사 효소는 단일 가닥의 RNA가 상보 적 가닥의 DNA로 번역 될 수있게한다. 이러한 반응이 발생하면, 일상적인 PCR 방법을 사용하여 DNA를 증폭시킬 수 있습니다. RT-PCR은 많은 RNA 바이러스를 탐지하고 연구하는 데 사용되었습니다.

RT-PCR을 Real-Time PCR이라고하는 PCR의 다른 변형과 혼동해서는 안됩니다. Real-Time PCR은 일반적인 절차의 40주기 동안 증폭 된 DNA를 분석 할 수있는 PCR의 변형입니다. 절차는 사이클링이있는 기존 PCR과 유사하지만 Real-Time PCR은 일부 빌딩 블록 또는 작은 뉴클레오티드 가닥에 부착 된 형광 염료를 사용합니다. 사용 된 방법에 따라, 증폭 된 DNA 가닥이 형성 될 때 형광이 발생한다. 형광의 양은 40 사이클에 걸쳐 측정 될 수 있으며, 연구자는 증폭 사이클 동안 특정 생성물 및 그 양을 측정 할 수있다. 이를 통해 연구자 또는 실험실 기술자는 종종 겔 전기 영동 또는 PCR 제품 분석에 필요한 기타 보조 절차를 건너 뛰어 더 빠른 결과를 얻을 수 있습니다.

Real-Time PCR 및 RT-PCR은 원래 PCR 테스트의 변형 또는 수정입니다. 그러나 더 많은 변형 (최소 25 개)이 존재하며 특정 문제를 해결하는 데 사용됩니다. 그들은 모두 어셈블리 PCR, 핫 스타트 PCR, 멀티 플렉스 PCR, 고체상 PCR 등의 다른 이름을 가지고 있습니다.

의학, 생물학의 다른 질문에 대한 답변을 돕기 위해 PCR은 계속 수정 될 것입니다. 그리고 다른 분야의 연구.